苹果酸是怎么形成的
作者：网管
来源：本站原创
日期：2015/8/12 10:26:00
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L-苹果酸广泛存在于生物体中，是生物体三羧酸循环的成员。苹果酸广泛应用于食品领域。因为苹果酸具有比柠檬酸柔和的酸味，滞留时间长和口味更好的优点，所以作为食品酸味剂更为理想。
许多微生物都能产生苹果酸，但能在培养液中积累苹果酸并适合于工业生产的，目前仅限于少数几种，大致有：用于一步发酵法的黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉；用于两步发酵法的华根霉、无根根霉、短乳杆菌、膜睽毕赤酵母；用于酶转化法的短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌。 3.5.1 一步发酵法
以糖类为发酵原料，用霉菌直接发酵生产L-苹果酸的方法称为一步发酵法。 1) 菌种
一步发酵法采用黄曲霉A-114生产苹果酸。 2) 种子培养基组成(%)
C6H12O6 3，豆饼粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02，NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(单独灭菌)。 3) 种子培养
将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下并移接到装有100ml种子培养基的500m1三角瓶中，在33℃下静置培养2~4d，待长出大量孢子后，将其转入到种子罐扩大培养，接种量为5%。种子罐的培养基与三角瓶培养基的组成相同，只是另外添加0.4%(体积分数)泡敌。种子罐的装液量为70%，罐压0.1MPa，培养温度33~34℃，通风量0.15~0.3m3/m3.min，培养时间18~20h。 4) 发酵培养基组成
C6H12O6 7%~8%，其余成分的组成及用量与种子罐培养基相同。 5) 发酵
发酵罐的装液量为70%，接种量10%，罐压0.1MPa，培养温度33~34℃，通风量0.7m3/（m3.min)，搅拌转速180r/min，发酵时间40h左右。发酵过程中由自动系统控制滴加泡敌，防止泡沫产生过多。当残糖在1%以下时，终止发酵，产苹果酸7%。 3.5.2 两步发酵法
两步发酵法是以糖类为原料，先由根霉菌发酵生成富马酸(延胡索酸)和苹果酸的混合物，然后接人酵母或细菌，将混合物中的富马酸转化为苹果酸。 1) 富马酸发酵 ① 菌种
两步发酵法以华根霉6508为菌种生产苹果酸。 ② 斜面培养
华根霉6508于葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面上，30℃培养7d，易于长出大量孢子。 ③ 摇瓶发酵 a 培养基组成(%)
C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10，MgSO4 0.05，FeCl3 0.002，CaCO3 5(单独灭菌)。 b 富马酸发酵
在500ml三角瓶中装入50ml培养基，灭菌，冷却。接种华根霉孢子，置往复式摇床上，于30℃下培养4~5d，发酵得到含富马酸和苹果酸的混合液。 c 转换发酵 a) 酶转化法
酶转化法是国外用来生产L-苹果酸的主要方法。酶转化法是以富马酸盐为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸(盐)。酶转化法可分为游离细胞酶法、固定化细胞酶法。 b) 游离细胞酶转化法
酶转化方法 在pH7.5含18%富马酸的溶液中接入2%湿菌体，于35℃、150r/min条件下转化24~36h。转化率达90%以上。
固定化细胞酶转化法
目前，研究得最多的是以产氨短杆菌或黄色短杆菌为菌种，将化学法合成的富马酸钠作为底物，进行固定化细胞生产苹果酸。使用固定化细胞易于生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此，细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止这种副反应的发生。采用固定化技术必须注意以下几个问题：
细胞被固定前富马酸酶活力要高。当富马酸酶活力较高时，即使固定化细胞的酶活力有所下降，仍可以保证有较高的转化力；使用的固定化方法对酶的损害较小，细胞被固定后能保持较高的酶活力；细胞被固定后不应引起副反应的发生；固定化细胞应有高度的操作稳定性； 3.5.3 苹果酸的提取和精制 1) 从发酵醪液中提取苹果酸 ① 工艺流程
发酵液→酸解→过滤→滤液→中和→过滤→沉淀→酸解→过滤→滤液→精制→浓缩→结品→干燥→成品 ② 操作方法
在发酵醪液中边搅拌边加入无砷硫酸，将pH值调节至1.5左右；过滤除去沉淀后，在滤液中加入碳酸钙，直到不再有CO2放出，此时生成苹果酸钙；接着，用石灰乳将体系的pH值调至7.5，静置6~8h。过滤，收集苹果酸钙沉淀，并用少量冷水洗去沉淀中的残糖和其他可溶性杂质；在苹果酸钙盐中加入近一倍量的温水，搅拌成悬浊液，接着加入无砷硫酸，使pH达到1.5左右，继续搅拌30min，最后静置数小时，使石膏渣沉淀充分析出；过滤，制得粗制苹果酸溶液，其中含有微量富马酸、Fe2+、Ca2+、Mg2+和色素；从联合柱流出的高纯度苹果酸溶液，在70℃下减压浓缩到苹果酸浓度为65%~80%，然后冷却至20℃，添加晶种析晶；晶体于40~50℃下真空干燥，得苹果酸成品。 2) 从混杂富马酸发酵醪液中提取苹果酸 ① 工艺流程
发酵廖液→浓缩→析出富马酸结晶→过滤→滤液→浓缩→析出富马酸结晶→过滤→滤液→冷却，加晶种→苹果酸结晶→干燥→成品 ② 操作方法
将发酵醪液浓缩到苹果酸浓度为50%并冷却至20~30℃，使富马酸结晶析出；
过滤除去富马酸后，母液在70℃下减压浓缩到苹果酸浓度为65%~80%，再冷却至20℃使富马酸结晶再次析出。为了防止苹果酸与富马酸同时析出，造成苹果酸提取收率下降，结温度不宜低于20℃； 将过滤除去富马酸结晶后的苹果酸溶液冷却至20℃，投入苹果酸品种，缓慢搅拌，使苹果酸结晶徐徐析出。
2) 从酶法转化液中提取苹果酸
从固定化细胞反应柱中流出的酶法转化液是清亮的，其中苹果酸盐含量为12.5%左右，富马酸盐含量为3%左右。在上述转化液中加入硫酸，使富马酸结晶析出，过滤后往滤液中添加碳酸钙，使苹果酸形成苹果酸钙沉淀析出。将苹果酸钙沉淀用硫酸酸解，酸解液经阴离子交换树脂处理后浓缩结晶，得苹果酸成品。游离细胞酶法转化液在除去细胞和其他不溶物后，按上述方法处理。